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抗體常見問題之IHC

問題 原因 解決方案
邊緣效應 組織邊緣貼附不牢,邊緣組織松脫漂浮于液體中 APES/多聚賴氨酸處理玻片;組織切片盡量薄;盡量避免選用壞死較多的組織
試劑未充分覆蓋組織 滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織
非特異性染色體 抗體質量問題 使用質量有保證的抗體
抗體孵育時間長 減少孵育時間
抗體濃度過高 降低抗體濃度
一抗為多抗 使用單克隆抗體
內源性過氧化物酶及生物素 延長滅活時間
封閉不足 延長封閉時間
DAB孵育時間過久或濃度過高 按說明書配置試劑,鏡下控制反應時間
抗體孵育后洗滌不充分 每次孵育之后洗3*5次
滴加試劑時干片 及時滴加試劑
切片在緩沖液中浸泡過久 抗原修復之后及時封閉加一抗,不能過夜
陰性結果 抗體濃度及質量 選擇有質量保證的抗體,先做預實驗摸索抗體使用濃度
抗原修復不全 摸索合適的抗原修復方式及修復時間
抗原豐度 正常陰性
封閉時間過長 減少封閉時間
DAB孵育時間短 鏡下控制顯色時間
細胞通透不全,抗體未能進入細胞反應 選擇合適的通透劑及其反應時間
一抗二抗不匹配 選擇正確來源的二抗
脫片 玻片未處理好 玻片清洗干凈后用APES或多聚賴氨酸處理
切片厚薄不均勻 更換刀片;調整好切片機狀態
烤片時間或溫度不夠 60攝食度2小時
組織自身問題 腫瘤壞死組織及骨組織本身易脫片
抗原修復時溫度迅速變化 抗原修復后讓其自然冷卻
操作時用力過猛 有脫片嫌疑的切片不要用力甩,用吸水紙吸干殘余液體
染色弱 抗體濃度低,孵育時間短 提高抗體濃度,延長反應時間
試劑使用超過有效期 試劑定時更新
滴加試劑時殘余緩沖液過多使試劑稀釋 滴加試劑前盡量減少殘余液體
封閉過度 減少封閉時間
著色不均勻 切片厚度不一致 更換刀片;調整好切片機狀態
試劑配制未混勻使局部濃度不一致 試劑充分混勻后滴加
試劑未完全覆蓋組織 滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織
脫蠟不完全 更換脫蠟劑或延長脫蠟時間